海藻糖的應(yīng)用條件優(yōu)化

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摘要：以淀粉為底物，通過麥芽糖基海藻糖合成酶（maltosyltrehalosesynthase,MTSase）和麥芽糖基海藻糖水解酶（maltosyltrehalosehydrolase,MTHase）兩種酶的共同作用生產(chǎn)海藻糖是一種經(jīng)濟高效的方法。對ArthrobacterramosusS34來源并分別在E.coliBL21(DE3)中表達的MTSase和MTHase的酶學(xué)性質(zhì)進行研究，發(fā)現(xiàn)MTSase的最適溫度為45℃，最適pH為7.0，MTHase的最適溫度為55℃，最適pH為6.0。隨后用2種酶共同作用生產(chǎn)海藻糖，優(yōu)化反應(yīng)條件，考查反應(yīng)溫度、初始pH、底物DE值、加酶量以及底物濃度等因素對酶轉(zhuǎn)化過程中海藻糖產(chǎn)率的影響。最佳酶轉(zhuǎn)化條件為反應(yīng)溫度45℃、初始pH5.5，底物DE值8.5，加酶量分別為MTSase最小加量15.75U/g淀粉，MTHase最小加量7.5U/g淀粉。

關(guān)鍵詞：海藻糖；麥芽糖基海藻糖合成酶（maltosyltrehalosesynthase,MTSase）；麥芽糖基海藻糖水解酶（maltosyltrehalosehydrolase,MTHase）；酶學(xué)性質(zhì)；酶轉(zhuǎn)化

海藻糖是一種在自然界中普遍存在的非還原性二糖，以穩(wěn)定的α,?1,1-糖苷鍵連接，不能被α-葡萄糖苷酶分解[1]。海藻糖無毒，作為糖類能夠為生物體提供能量和碳源。另有研究表明，當(dāng)海藻糖與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、組織、器官等共存時，能夠幫助它們抵抗環(huán)境壓力，因此海藻糖還可用于生物物質(zhì)的保存[2,3]。目前已有研究指出不同的酶系統(tǒng)可以有效地以麥芽糖，蔗糖和淀粉作為底物分別產(chǎn)生海藻糖[4-6]。1994年，有研究所發(fā)現(xiàn)2種不同的酶，麥芽糖基海藻糖合成酶（maltosyltrehalosesynthase,MTSase）和麥芽糖基海藻糖水解酶（maltosyltrehalosehydrolase,MTHase）在以淀粉作為反應(yīng)起始底物時，在產(chǎn)生海藻糖的過程中起重要作用[7]。之后，又有研究人員報道了以蔗糖為底物通過三種不同的酶（海藻糖磷酸化酶，蔗糖磷酸化酶和葡萄糖異構(gòu)酶）進行海藻糖代謝的合成[4]。1998年，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，通過海藻糖合酶可以使以α-1,4-糖苷鍵連接的麥芽糖重組轉(zhuǎn)變?yōu)橐驭??1,1-糖苷鍵連接的海藻糖，實現(xiàn)以麥芽糖為底物合成海藻糖[8,9]?？紤]工業(yè)應(yīng)用中的成本因素，雙酶法所用的底物是比蔗糖和麥芽糖更便宜的淀粉，因此以MTSase和MTHase生產(chǎn)海藻糖是最具成本效益的方法。在雙酶法生成海藻糖的過程中，淀粉液化后，位于糊精末端的兩個葡萄糖分子間的α-1,4-糖苷鍵可在MTSase的催化下轉(zhuǎn)化為α,?1,1-糖苷鍵，使其變成帶有一分子海藻糖的糊精。此后，經(jīng)MTHase的水解作用將其水解成兩部分，一部分為目標(biāo)產(chǎn)物海藻糖分子，另一部分為減少兩個葡萄糖分子的糊精，而第二部分的糊精則作為底物參與下一輪反應(yīng)，繼續(xù)生產(chǎn)海藻糖[7]。在國內(nèi)外的相關(guān)研究中，已經(jīng)對根瘤菌[10]，谷氨酸棒狀桿菌[11]，微黃短桿菌[6]，節(jié)桿菌[12]，分支節(jié)桿菌[7]，芝田硫化葉菌[13]以及嗜熱硫礦硫化葉菌[14]來源的MTSase和MTHase兩種酶基因進行了克隆表達，并對兩種酶的酶學(xué)性質(zhì)及在生產(chǎn)海藻糖過程中的應(yīng)用條件進行了研究。MTSase和MTHase兩種酶分別由基因treY和treZ控制表達，本實驗室于前期構(gòu)建了分別含有treY和treZ的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-24a-treY和E.coliBL21(DE3)/pET-24a-treZ，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)目的基因源自于ArthrobacterramosusS34的兩株基因工程菌的發(fā)酵酶活明顯高于已報道的該來源兩種酶的發(fā)酵酶活，具有較高的應(yīng)用價值，相關(guān)論文目前還未發(fā)表。此來源的兩種酶在E.coliBL21(DE3)中的重組表達之前未有報道，因此本研究對這兩種重組酶的酶學(xué)性質(zhì)以及在制備海藻糖過程中的條件優(yōu)化進行了研究。

1材料與方法

1.1材料與試劑，海藻糖、麥芽四糖、麥芽六糖購買于美國Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備，安捷倫1200高效液相色譜系統(tǒng)購買于美國Agilent公司。

1.3方法：

1.3.1MTSase和MTHase酶活力的測定MTSase酶活測定：10uL稀釋一定倍數(shù)的MTSase酶液（空白加高溫滅活的MTSase），加到190uL的10g/L的麥芽六糖溶液中（20mmol/LpH6.0的磷酸鹽緩沖液配制），45℃反應(yīng)10min，100℃沸水中煮10min終止反應(yīng)。取100uL反應(yīng)液于10mL具塞試管中，注入900uL水和1mLDNS溶液，沸水中煮7min，加水補至10mL，最后在540nm波長下測定吸光度值。MTSase的酶活單位定義為：在45℃時，其他條件恒定，單位時間內(nèi)每消耗1umol麥芽六糖所需的酶量。酶活公式：MTHase酶活測定：10uLMTSase濃縮酶液加到490uL10g?L-1的麥芽六糖溶液中（20mmol/LpH6.0的磷酸鹽緩沖液配制），45℃反應(yīng)2h，100℃沸水中煮10min終止反應(yīng)。待溶液冷卻后，加入10uL稀釋一定倍數(shù)的MTHase酶液（空白加高溫滅活的MTHase）到190uL的處理過的底物中，55℃反應(yīng)10min，100℃沸水中煮10min終止反應(yīng)，取100uL反應(yīng)液，加入900uL水和1mLDNS溶液，沸水中煮7min，加水補至10mL，最后在540nm波長下測定吸光度值。MTHase的酶活單位定義為：在55℃時，其他條件恒定，單位時間內(nèi)轉(zhuǎn)化生成1umol麥芽四糖所需的酶量。

1.3.2重組蛋白酶學(xué)性質(zhì)的研究1.3.2.1重組MTSase和MTHase的最適溫度分別將底物置于35、40、45、50、55、60、65℃等不同溫度水浴中預(yù)熱3min，按照1.3.1所述方法測定酶活，算出百分比。定義最高酶活為100%。1.3.2.2重組MTSase和MTHase的溫度穩(wěn)定性將酶液置于45℃中保溫，定期取樣按照1.3.1操作步驟測定殘余酶活，算出百分比（設(shè)定0h酶活為100%）。1.3.2.3重組MTSase和MTHase的最適pH將酶液分別置于20mmol?L-1pH為4.0~8.0（梯度為0.5）的緩沖液中，在相應(yīng)溫度下預(yù)熱3min，按照1.3.1所述方法測定相應(yīng)pH條件下的酶活，算出百分比，定義最高酶活為100%。1.3.2.4重組MTSase和MTHase的pH穩(wěn)定性將酶分別置于20mmol/LpH4.0-8.0（梯度為0.5）緩沖液中，于4℃靜置24h，按照1.3.1操作步驟測定剩余酶活，算出百分比(設(shè)定0h酶活為100%)。1.3.3MTSase和MTHase制備海藻糖的工藝條件優(yōu)化1.3.3.1反應(yīng)溫度的優(yōu)化200g/L的玉米淀粉液化至DE值10，初始pH為6.0，加入5U/g淀粉的普魯蘭酶，30U/g底物的MTSase和MTHase在150r/min的水浴搖床中進行反應(yīng)。溫度分別設(shè)置為35、40、45、50、55℃，反應(yīng)36h后終止反應(yīng)并煮沸處理。產(chǎn)物稀釋沉淀后用液相測定其中海藻糖含量，算出產(chǎn)率。1.3.3.2底物DE值的優(yōu)化200g/L的玉米淀粉液化至DE值分別達到3.5、6.5、8.5和10.5，初始pH為6.0，加入5U/g淀粉的普魯蘭酶，30U/g的MTSase和MTHase在45℃，150r/min水浴搖床中反應(yīng)36h后終止反應(yīng)并煮沸處理。液相測定其中海藻糖含量，算出產(chǎn)率。1.3.3.3初始pH的優(yōu)化200g/L的玉米淀粉液化至DE值8.5，加入5U/g淀粉的普魯蘭酶，30U/g的MTSase和MTHase，分別調(diào)節(jié)初始pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0在45℃，150r/min水浴搖床中反應(yīng)36h后終止反應(yīng)并煮沸處理。測定其中海藻糖含量，算出產(chǎn)率。1.3.3.4加酶量的優(yōu)化200g/L的玉米淀粉液化至DE值8.5，初始pH為5.5，加入5U/g淀粉的普魯蘭酶，再分別加入終濃度為114、75.5、38、19、7.5、3.75、1.875U/g底物的MTHase和終濃度為31.5U/g底物的MTSase。另外分別加入終濃度為31.5、15.75、7.875、3.15、1.575U/g的MTSase和終濃度為114U/g底物的MTHase在45℃，150r/min水浴搖床中反應(yīng)36h后終止反應(yīng)并煮沸處理。液相測定其中海藻糖含量，算出產(chǎn)率。1.3.3.5底物含量的優(yōu)化分別配置170、240、270、320g/L的玉米淀粉作為底物，液化至DE值8.5，初始pH為5.5，加入5U/g淀粉的普魯蘭酶，30U/g底物的MTSase和MTHase在45℃，150r/min的水浴搖床中反應(yīng)36h后終止反應(yīng)并煮沸處理。測定其中海藻糖含量，算出產(chǎn)率。

1.3.4海藻糖轉(zhuǎn)化率的測定產(chǎn)物中的海藻糖含量采用高效液相色譜檢測，NH2柱，體積分數(shù)80%的乙腈溶液，流速為0.8mL/min，柱溫為40℃。1.3.5海藻糖轉(zhuǎn)化率的計算1.3.6優(yōu)化條件下反應(yīng)過程中海藻糖產(chǎn)量的測定170g/L的玉米淀粉液化至DE值8.5，初始pH為5.5，加入5U/g淀粉的普魯蘭酶，15.75U/g底物的MTSase和7.5U/g底物的MTHase在45℃，150r/min的水浴搖床中反應(yīng)。反應(yīng)過程中每隔6h進行一次取樣并煮沸處理，36h后終止反應(yīng)。測定其中海藻糖含量，算出產(chǎn)率。

2結(jié)果與討論

2.1重組MTSase和MTHase的酶學(xué)性質(zhì)2.1.1重組蛋白最適溫度及溫度穩(wěn)定性蛋白酶的催化反應(yīng)速率與反應(yīng)溫度密切相關(guān)。如圖1示，MTSase的最適溫度為45℃，MTHase的最適溫度為55℃。在一定溫度范圍內(nèi)，重組MTSase和MTHase的酶活性隨著溫度的升高也呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，由于過高的溫度會使蛋白質(zhì)性質(zhì)發(fā)生不可逆的改變，當(dāng)溫度高于45℃時，MTSase的活性隨著溫度的升高開始降低；當(dāng)溫度高于55℃時，MTHase的活性開始降低。MTSase和MTHase在45℃、50℃下的穩(wěn)定性結(jié)果顯示在圖2中。MTSase和MTHase在45℃的半衰期分別為96h和6h，在50℃的半衰期分別為50h和3h?？梢钥闯?，MTSase在45℃和50℃時具有較高的穩(wěn)定性，MTHase在兩種溫度下的穩(wěn)定性都比較差。2.1.2重組蛋白最適pH及pH穩(wěn)定性酶反應(yīng)的反應(yīng)速率會受到環(huán)境pH的影響。如圖3所示，MTSase在pH值5.5~8.0的范圍內(nèi)均有70%以上的酶活，并在pH7.0的環(huán)境下，測得的酶活最高，大于或小于7.0的pH環(huán)境都會使酶活逐漸降低。MTHase的最適pH為6.0，在大于6.0的pH環(huán)境下，MTHase的活性急速降低，如當(dāng)pH為6.5時，酶活相對值迅速降低至57.9%；而在小于6.0大于5.0的pH時，MTHase的酶活能夠穩(wěn)定在一定的范圍，達到酶活相對值85%以上；在更低的pH（<5.0）時，MTHase的酶活相對值則急速降低到42%以下。綜上，重組MTHase適合的pH范圍應(yīng)為5.0~6.0。另外，pH穩(wěn)定性結(jié)果（圖4）表明，在4℃時，MTSase和MTHase在pH4.0~8.0均能保證較好的穩(wěn)定性。

2.2重組MTSase和重組MTHase制備海藻糖的工藝條件

2.2.1反應(yīng)溫度與海藻糖轉(zhuǎn)化率的關(guān)系溫度會使酶的酶活性大小以及酶的穩(wěn)定性發(fā)生改變，從而改變海藻糖的產(chǎn)率。如圖5所示，在反應(yīng)溫度逐漸升高時，海藻糖的轉(zhuǎn)化率也隨著提高，并在45℃時到達最高值，為54.2%。但在45℃之后，海藻糖的轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高快速下降，這可能是高溫使得MTHase快速失活而導(dǎo)致的。綜合以上因素，最終選擇45℃作為轉(zhuǎn)化產(chǎn)海藻糖的反應(yīng)溫度。

2.2.2底物液化DE值與海藻糖轉(zhuǎn)化率的關(guān)系底物玉米淀粉液化結(jié)束時的DE值會對與海藻糖的轉(zhuǎn)化率之間也有著密切的聯(lián)系。如圖6所示，海藻糖的轉(zhuǎn)化率隨著DE值的升高而增加，并在DE值為8.5時達到最大值56.8%。這可能是因為在DE值過低時，糊化過的淀粉底物在溫度自然下降的過程中更易發(fā)生老化，使得淀粉內(nèi)部已被破壞的分子氫鍵再次結(jié)合，隨著部分分子的有序排列，即造成結(jié)晶沉淀，從而使得底物利用率大大降低[15]。而當(dāng)?shù)孜顳E值達到8.5時，更高的DE值代表著更低的聚合度，由于MTSase和MTHase在反應(yīng)過程中只會對聚合度≧3的糖鏈起作用[7]，因此在一定范圍內(nèi)，底物轉(zhuǎn)化成海藻糖的轉(zhuǎn)化率會隨著淀粉底物聚合度的降低而減少，因此，在DE值為8.5時，最適合進行底物制備海藻糖的反應(yīng)。

2.2.3初始pH與海藻糖轉(zhuǎn)化率的關(guān)系由圖7可以看出，重組MTSase和重組MTHase轉(zhuǎn)化底物生成海藻糖的最適初始pH為5.5。初始pH低于5.5或過高時，海藻糖轉(zhuǎn)化率顯著降低，很可能是一方面過高或過低的pH使得酶活性中心的構(gòu)象發(fā)生改變，甚至改變了酶分子的整體結(jié)構(gòu)使其變形失活，導(dǎo)致酶分子的穩(wěn)定性大大降低；另一方面可能是不同pH會對酶活性中心附近相關(guān)基團的解離狀態(tài)產(chǎn)生一定的影響，造成活性部位與底物結(jié)合難易度的區(qū)別[16]。當(dāng)初始pH處于5.5~6.5之間時，海藻糖轉(zhuǎn)化率也逐漸減少，可能是因為在該pH范圍內(nèi)，不同pH導(dǎo)致酶穩(wěn)定性的變化，而這種變化對海藻糖產(chǎn)率的影響高于酶最適pH對其的影響。綜上考慮，選擇5.5作為反應(yīng)的初始pH。

2.2.4加酶量與海藻糖轉(zhuǎn)化率的關(guān)系加酶量是影響海藻糖轉(zhuǎn)化率的重要因素，由于海藻糖的轉(zhuǎn)化需要MTSase和MTHase的共同作用，因此對兩種酶的加量進行了研究。如圖8所示，在加酶量充足的情況下，兩種酶的加量比例對海藻糖的轉(zhuǎn)化率沒有明顯的影響。在轉(zhuǎn)化過程中，如要保證一定的海藻糖轉(zhuǎn)化率，兩種酶都有對應(yīng)的最少加量。如圖8（a），加入足量恒定的MTHase時，控制MTSase的加量，當(dāng)其降低到15.75U/g時，依然能夠保持65%以上的轉(zhuǎn)化率，而當(dāng)MTSase的加量降低到7.875U/g時，海藻糖轉(zhuǎn)化率則直接降低到55%。如圖8（b），加入足量恒定的MTSase時，控制MTHase的加量，在其加量≧7.5U/g時，海藻糖轉(zhuǎn)化率可始終穩(wěn)定在63%以上。因此，在酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)海藻糖過程中，MTSase和MTHase的最少加量分別為15.75U/g和7.5U/g。

2.2.5底物濃度與海藻糖轉(zhuǎn)化率的關(guān)系為了提高工業(yè)生產(chǎn)中制備海藻糖的效率，研究了底物濃度對兩種酶共同作用生成海藻糖的轉(zhuǎn)化率的影響，分別在17%、24%、27%、32%四個不同的底物濃度下對其進行研究。結(jié)果（圖9）顯示，更高的底物濃度會伴隨有更低的海藻糖轉(zhuǎn)化率，其轉(zhuǎn)化率最高點在底物濃度為17%時達到，為67.7%。雖然海藻糖轉(zhuǎn)化率隨著底物濃度的升高而逐漸降低，但考慮到工業(yè)生產(chǎn)中進行一批生產(chǎn)所需的人力物力是一定的，因此在具體生產(chǎn)過程中，應(yīng)對總體成本進行核算，以選取最佳底物濃度。

2.2.6優(yōu)化條件下海藻糖產(chǎn)量的過程研究經(jīng)條件優(yōu)化后得知，MTHase和MTSase協(xié)同作用產(chǎn)海藻糖在45℃時能達到最高的產(chǎn)率?？紤]到MTHase在45℃時的半衰期為6h，因此在45℃下對海藻糖轉(zhuǎn)化進行過程研究。同時，作為對照，在反應(yīng)進行到12h時，向反應(yīng)體系中補加終濃度為7.5U/g底物的MTHase，繼續(xù)反應(yīng)至36h。結(jié)果（圖10）表明，補加MTHase對海藻糖最終的轉(zhuǎn)化率沒有明顯提高。主要的轉(zhuǎn)化過程在前24h完成，在24h到30h的時間里，海藻糖含量的增速降低，但依然在增加，直到轉(zhuǎn)化進行到30h~36h之間時，海藻糖含量開始穩(wěn)定。這表明在整個反應(yīng)過程中，MTHase均有著合適的酶活性來保證反應(yīng)的進行，分析原因可能是當(dāng)酶液與底物共同存在時，底物對MTHase具有保護作用。

3結(jié)論

本研究中重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-24a-treY和E.coliBL21(DE3)/pET-24a-treZ能夠分別高效表達MTHase和MTSase，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，MTSase的最適溫度為45℃，最適pH為7.0，MTHase的最適溫度為55℃，最適pH為6.0。在兩種酶的產(chǎn)海藻糖應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)其最適轉(zhuǎn)化溫度和pH為45℃、初始pH5.5，這與其酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果相對應(yīng)。另外，其最適底物DE值為8.5，過高和過低的DE值對其轉(zhuǎn)化率的影響都較大，因此后期在實際工廠生產(chǎn)中應(yīng)嚴格控制底物淀粉的液化時間，以使其DE值達到8.5左右，保證海藻糖轉(zhuǎn)化率。在反應(yīng)過程中，MTSase和MTHase最小加量分別為15.75U/g淀粉和7.5U/g淀粉，并且過量的兩種酶對海藻糖的轉(zhuǎn)化率都沒有明顯的影響。因此，在生產(chǎn)過程中，可以適當(dāng)?shù)脑黾覯TSase和MTHase兩種酶的加量，保證反應(yīng)的正常進行。最后，底物濃度對反應(yīng)的進行也有著較大的影響，在其他條件恒定時，轉(zhuǎn)化率在一定范圍內(nèi)隨著底物濃度的升高而降低。同時考慮到生產(chǎn)過程中的成本問題，應(yīng)當(dāng)結(jié)合具體情況，全面考慮以選擇最優(yōu)的底物濃度。綜上，本研究對兩種重組酶在海藻糖的生產(chǎn)中的應(yīng)用，具有一定的指導(dǎo)作用。

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作者：王魁1，2宿玲恰1，2吳敬1，2陳晟1，2* 單位：1江南大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室2,生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室