血液腫瘤樹突狀細胞

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樹突狀細胞（DendriticCells，DC）是目前體內(nèi)功能最強的專職抗原呈遞細胞，具有啟動T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的功能。本文介紹DC在血液腫瘤中誘導(dǎo)的自身腫瘤殺傷活性、移植免疫、治療及預(yù)后等方面的研究。

樹突狀細胞（DendriticCells,DC）是近年來倍受人們關(guān)注的專職抗原呈遞細胞（AntigenpresentingCells,APC），能攝取、加工及呈遞抗原，啟動T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。DC于1973年首次由Steinman和Cohn發(fā)現(xiàn)。近年來關(guān)于DC分化、發(fā)育及抗腫瘤應(yīng)用尤其受到人們的關(guān)注。本文對血液腫瘤DC的研究作一綜述。

1DC誘導(dǎo)的自身腫瘤殺傷活性

Choudhury等[1]報道，慢性髓系白血?。–ML）慢性期患者外周血單個核細胞與細胞因子-粒單核細胞集落刺激因子（CM-CSF）、白介素4（IL-4）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）在體外共同孵育后，產(chǎn)生了形態(tài)學(xué)、免疫表型具有DC特征的細胞，熒光原位雜交（FISH）表明這些細胞中t（9；22）的存在，說明它們來自白血病細胞。特異的體外測定DC的功能證實這些細胞具有潛在刺激淋巴細胞增殖的作用。體外產(chǎn)生的白血病DC刺激自體T細胞產(chǎn)生了強烈的抗白血病細胞的細胞毒活性，但對主要組織相容性復(fù)合物（MajorhistocompatibilityComplex,MHC）匹配的正常異體骨髓細胞表現(xiàn)為低反應(yīng)。用DC刺激的自體T細胞抗CML靶細胞的細胞毒活性，是體外單用IL-2培養(yǎng)擴增的自體T細胞作用的4～6倍。DC刺激的T細胞也抑制CML克隆前體的生長。這些結(jié)果表明，體外細胞因子誘導(dǎo)CML細胞向DC分化，這些DC具有明顯的T細胞刺激功能。體外產(chǎn)生的DC通過對白血病特異性抗原的有效傳遞產(chǎn)生抗白血病作用。Robinson等[2]報道，急性白血?。ˋL）細胞在上述細胞因子的作用下亦能向DC分化。作者用21例AL患者的外周血單個核細胞與GM-CSF、TNF-α共同孵育，15例細胞成活，其中12例可觀察到符合DC典型的形態(tài)學(xué)特征。流式細胞分析顯示，這些細胞有DC特異性抗原CD1a、CD83的表達，成熟DC還有HLA-DR、CD40、CD80、CD86的表達。9/12例中混合淋巴細胞反應(yīng)（MLR）測定，這些培養(yǎng)的細胞具有很強的抗原呈遞功能，經(jīng)FISH分析證實，一些AML的DC起源于5q-及ph+白血病細胞，另外2例髓系和淋巴系雙表型白血病CD19持續(xù)異常表達。AML惡性轉(zhuǎn)變發(fā)生在多能干細胞水平，但是體內(nèi)隨后白血病細胞的分化被局限于某一細胞系、然而體外白血病克隆50%可自然向單核細胞、粒細胞成熟，另外在細胞因子的作用下可進一步終末細胞分化。該研究證實了AL原始細胞衍生的DC是惡性起源的，表明一種惡性細胞向具有潛在抗原呈遞能力的細胞轉(zhuǎn)變，這類細胞具有很強的呈遞腫瘤相關(guān)抗原的能力，因此可以用于誘導(dǎo)抗白血病免疫反應(yīng)。需指出的是，DC的白血病起源由以下證據(jù)支持：①在培養(yǎng)的外周血單個核細胞中白血病原始細胞占90%～98%，細胞數(shù)量在整個培養(yǎng)階段維持穩(wěn)定且具有恒定的高存活力；②在GM-CSF、TNF-α中培養(yǎng)后觀察到的DC占73%～92%，比在相同條件下正常祖細胞衍生的DC比例高；③AL單個核細胞生成的DC與正常DC前體行為不一致。體外來自12/15例AL所產(chǎn)生的潛在抗原呈遞DC，這一發(fā)現(xiàn)提出的兩大重要問題有待于進一步研究：①一種早期干細胞表型是這種現(xiàn)象的先決條件嗎？AL與其它白血病的進一步研究，需要確定是否如此，以及該現(xiàn)象的真正頻率和生物學(xué)重要性；②這種體外成熟能允許假定的白血病相關(guān)抗原更有效地呈遞到有適當(dāng)受體的細胞毒T細胞嗎？

Choudhury等[3]報道，AML包括一組血及骨髓中原始髓細胞克隆積累的疾病，惡性細胞表現(xiàn)為髓細胞分化的變異程度及與許多特征性的細胞遺傳異常和基因重排有關(guān)，特殊的細胞遺傳變化通常與特殊疾病表型和臨床后果有關(guān)。正常多能造血干細胞與白血病克隆共存于骨髓。成功的抗白血病治療后，骨髓正常造血干細胞的造血功能得以恢復(fù)，但大多數(shù)病例，緩解僅為暫時的。因此，對于大多數(shù)AML病人的治療上的挑戰(zhàn)就在于防止復(fù)發(fā)，以期達到長期緩解。為此，Choudhury等[3]開展了體外誘導(dǎo)AML細胞分化成DC的工作，并以此來刺激自體的抗白血病的T細胞反應(yīng)。他們在體外用GM-CSF+IL-4聯(lián)合TNF-α或CD40配體（CD40L）產(chǎn)生DC，對象19例不同染色體異常的AML病人，除1例外均產(chǎn)生了DC的形態(tài)學(xué)表型特征及T細胞刺激特性，這些細胞高表達MHC-Ⅰ類、Ⅱ類抗原及共刺激分子CD86和ICAM-1。有3例通過FISH分析染色體異常。自體淋巴細胞與AML衍生的DC共同培養(yǎng)能溶解自體白血病細胞，并注意到少許抗自體的正常細胞的細胞毒活性，這些正常細胞來自于病人緩解期。結(jié)果顯示有DC表型、功能的細胞能從多數(shù)人AML標(biāo)本中獲得。如果已知AML的生物學(xué)異質(zhì)性，就不會奇怪實驗結(jié)果的變異及偶爾有AML細胞標(biāo)本未顯示有向DC分化。進一步研究這些細胞確?？蓻Q定靶抗原而進行被觀察到的免疫活性。這些工作潛在治療上的應(yīng)用是重要的，白血病DC可潛在地被用作體內(nèi)細胞的白血病疫苗或體外產(chǎn)生抗白血病的T細胞而用于免疫治療。它們在免疫治療上的應(yīng)用于這種通常致死性疾病可消除微小殘余疾病及將暫時的反應(yīng)轉(zhuǎn)變成持久緩解。

據(jù)Cao等[4]報道，GM-CSF可誘導(dǎo)鼠紅白血病細胞（FBL-3）分化成類單核細胞的細胞來刺激宿主對白血病的免疫反應(yīng)，即經(jīng)GM-CSF處理后的FBL-3細胞，DC的特異性標(biāo)志33D1及NLDC-145的表達陽性率顯著升高，同時MHC-Ⅱ類分子，CD80、CD86的表達及血管細胞粘附分子1（VCAM-1）表達顯著上調(diào)，通過電鏡觀察到DC典型的形態(tài)學(xué)。功能上，GM-CSF誘導(dǎo)的FBL-3細胞可明顯刺激初始異基因的和自體的T細胞的增殖，并誘導(dǎo)特異的細胞毒T細胞的產(chǎn)生?？傊@些結(jié)果對白血病的免疫治療有重要啟示。

2DC在移植免疫中的作用

Fujii等[5]提出，CD34+臍血細胞衍生的DC是可誘導(dǎo)抗腫瘤的細胞毒細胞，如細胞毒T細胞、NK細胞和單核細胞。用射線照射的MHC-Ⅰ類抗原陽性的K562細胞脈沖刺激的DC刺激臍血T細胞能選擇誘發(fā)清除K562mHC-Ⅰ類抗原，CD8+或MHC-Ⅰ抗原T細胞的這種殺傷活性幾乎完全被抗體消除，而CD4+T細胞則不同。這表明CD34+臍血細胞衍生的腫瘤細胞脈沖的DC能誘導(dǎo)抗相應(yīng)的腫瘤細胞的腫瘤特異性細胞毒T細胞，這些細胞毒T細胞是經(jīng)MHC-Ⅰ類分子識別腫瘤細胞的CD8+T細胞。這個發(fā)現(xiàn)具有潛在的重要性，提示DC在臍血移植中及在臨床免疫治療的應(yīng)用。

近來，臍血干細胞移植已被用于治療致死的先天性或惡性疾病，且取得顯著成功[6，7]。積累的實驗及臨床依據(jù)業(yè)已證明該臨床措施的有效性。臍血移植無需嚴(yán)格的HLA相合，GVHD發(fā)生機會少，這可能歸因于新生免疫系統(tǒng)的獨特性，更能耐受異已抗原。許多研究提示體外各種不同的功能測定中臍血與成人血比較而言缺乏T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞及DC。Harris等[8，9]與其他學(xué)者[10，11]報道臍血T淋巴細胞表型及功能如此不成熟以至于異基因刺激后很少產(chǎn)生細胞毒T細胞活性。大量證據(jù)表明：造血干、祖細胞起源的DC可專門呈遞抗原到初始T細胞，因此很有可能DC呈遞抗原是臍血初始T細胞激活所必需。對于腫瘤治療，研究者致力于將腫瘤抗原脈沖的DC用作治療性的疫苗，同時也用于體外采用T細胞治療中啟動腫瘤抗原特異的T細胞[12，13]。據(jù)近來報道，腫瘤抗原負載的DC的免疫作用代表了誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的有力措施[14，15]。本研究中，試圖用CD34+臍血細胞衍生的DC，誘導(dǎo)抗腫瘤細胞毒性活性作為臍血移植后GVL效應(yīng)的體外模型。

在不久的將來，臍血移植可能成為各種不同的致死性惡性腫瘤尤其血液腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療手段，因為它優(yōu)于其它干細胞來源的移植。但在臍血移植中，GVL效應(yīng)減少將成為一個問題。移植免疫治療的一個目標(biāo)是創(chuàng)造一種方法，即可避免GVHD、根除殘余腫瘤免疫的策略，也可激活臍血單個核細胞抗未知抗原承載的腫瘤細胞。總之，在造血干細胞移植中，正確使用DC可能有益于更特異和更有效的免疫治療。

外周血干細胞移植時，移植物DC可以直接激活宿主殘存的T細胞，導(dǎo)致移植物排斥和移植失敗。因此，去除移植細胞中DC，保留干細胞（CD34+HLA-DR-）的重建活性，將會提高移植的成功率[16]。同種異基因骨髓移植供者來源DC間接呈遞受者次要組織抗原，是GVHD發(fā)生的主要途徑[17]。此外，動物實驗表明，骨髓去除性治療只是去除了大部分，而不是全部的受者DC。

臨床移植中控制DC策略[18]：DC是刺激T細胞免疫反應(yīng)的專職APC，調(diào)控DC或干擾DC致敏途徑，有可能延長移植存活并促進耐受?？刂艱C的可能策略包括：①去除DC即移植前預(yù)處理移植物達到減少或消除移植物內(nèi)DC的目的，避免直接致敏從而延長移植物存活；②抑制DC移行或成熟，通過進一步研究DC移行機制，選擇調(diào)節(jié)DC移行和成熟的某種因子，有可能阻斷致敏途徑；③阻斷DC與T淋巴細胞共刺激信號，如用CTLA-4-Ig阻斷B7/BB1和CD28間作用有可能誘導(dǎo)耐受；④DC耐受作用，耐受與嵌合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，使人們重新認識DC在移植中作用，隨著對DC研究的深入，人們有希望篩選出某一類型DC，用于誘導(dǎo)移植嵌合體形成。

3DC治療腫瘤

DC的研究近年來已成為腫瘤治療研究的熱點，其分化發(fā)育及抗腫瘤應(yīng)用尤其受到人們關(guān)注。動物實驗表明應(yīng)用多種形式的腫瘤抗原體外沖擊致敏DC，少量回輸即可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生極強的抗腫瘤免疫[19]。DC的臨床試用亦有報道，DC回輸療法已試用于非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤（MM）晚期患者的治療。對于非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤的治療，是應(yīng)用抗獨特型抗體體外致敏的自體DC，目前已取得良好的臨床療效[15]。德國學(xué)者[20]應(yīng)用獨特型蛋白多肽體外致敏的自體DC回輸治療了7例MM患者。其作法是從MM患者血清中分離出獨特型蛋白，酶消化降解后用HPLC純化出多肽，然后用此多肽體外致敏CD34+細胞來源的自體DC，將此類DC給MM患者皮下注射，并隨后每隔2周皮下注射一次獨特型蛋白多肽，連續(xù)3次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在受檢查的4例MM患者中，有2例血中抗獨特型IgM和IgG抗體的水平分別升高約8倍和12倍，而且還觀察到獨特型蛋白的特異性T細胞免疫反應(yīng)，表明該療法的有效性和臨床應(yīng)用前景。

近來有關(guān)DC用于白血病治療研究的報道較多，鑒于未成熟DC具有一定的吞噬能力，F(xiàn)ujii等[21]報道，為了用DC在體外誘導(dǎo)出自體細胞毒T細胞然后用于白血病的免疫治療，將G-CSF動員的外周血CD34+細胞用GM-CSF和TNF-α體外培養(yǎng)出DC，這種DC混合群體（包括典型的成熟DC及未成熟DC）能攝取外源性蛋白抗原——鑰孔戚血藍素（KeyholdlimpetHemocyanin,KLH）并將之提呈給CD4+和CD8+T細胞，誘導(dǎo)出KLH特異性細胞毒T細胞。并且他們選擇3例AML患者，將放射性滅活的白血病細胞與DC、T細胞共同孵育后，結(jié)果其中2例誘導(dǎo)出能殺傷白血病細胞的自體細胞毒T細胞，從而為細胞毒T細胞過繼免疫治療奠定基礎(chǔ)。

4DC判斷預(yù)后

有關(guān)這方面的研究報道較少。Baur等[22]報道了濾泡型樹突狀細胞（FDC）在結(jié)節(jié)硬化型霍奇金病（NSHD）中的預(yù)后價值?；羝娼鸩ye分類中已建立的形態(tài)學(xué)表型、組織學(xué)顯示一個寬闊的范圍，然而這種組織學(xué)不同并未被考慮作為預(yù)后因素。NSHD病理組織學(xué)分級中兩個亞型NSⅠ（惡性）及NSⅡ（高度惡性）的預(yù)后相關(guān)性仍然存在著爭議，F(xiàn)DC的分析可提供新的預(yù)后參數(shù)。對59例NSHD進行研究，平均隨訪時間8年，按分類41例為NSⅠ，18例為NSⅡ。用耐石蠟的單克隆抗體CD21和CNA42免疫染色FDC，在腫瘤組織中區(qū)分出三種形式：FDC1，存在著廣義的濾泡樣結(jié)構(gòu)（n=20）；FDC2，存在大量被破壞的FDC網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（n=25）；FDC3，無或少許孤立的FDC（n=14）。這3組根據(jù)復(fù)發(fā)頻率及生存明顯不同，發(fā)現(xiàn)生存最長的是FDC1組，最短在FDC3組，F(xiàn)DC2組居中（P=0.0025）。FDC狀態(tài)是一個區(qū)別針對所有病人包括不同年齡和分期的預(yù)后因素。結(jié)合FDC狀態(tài)和NSⅠ-NSⅡ分級將最佳生存組定義為FDC1-NSⅠ，對于NSHD的傳統(tǒng)病理組織學(xué)檢查，F(xiàn)DC的分析是一種新的預(yù)后判斷方法。結(jié)果表明FDC狀態(tài)的評估更加準(zhǔn)確，其真正的預(yù)后價值有待于進一步的隨機臨床試驗應(yīng)用中加以評估。

對于DC的研究正受到人們的青睞。仍有許多問題尚未解決，如：如何調(diào)控DC的功能，使其選擇性發(fā)揮作用。DC用于腫瘤免疫治療大多仍處于實驗研究階段，但隨著研究的深入，人們對DC分化調(diào)控及DC活化機制的掌握，DC在腫瘤免疫治療中將會成為一種很有效的手段，具有廣闊的前景而得到廣泛的臨床應(yīng)用。

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