探究病毒的克隆技術(shù)

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1材料與方法

基因DNA模板、PCMV陽性血清、表達(dá)載體pET32a（＋）均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心提供，2月齡健康雄性白兔（體重2kg）購(gòu)自雅安市某家兔養(yǎng)殖基地。克隆載體pMD19－TSimple，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶、IPTG、蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；N，N’－亞甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、SDS、TEMED、考馬斯亮藍(lán)R－250、2－巰基乙醇、溴酚藍(lán)、瓊脂糖、甘油、氨芐青霉素、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、硫酸銨等均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，其他化學(xué)試劑均為分析純。引物的設(shè)計(jì)與合成應(yīng)用．0b等分子生物信息軟件對(duì)PCMVgB基因及其編碼氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并選擇gB基因2305～2574bp優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)作為目的序列，參照NCBI上的豬巨細(xì)胞病毒gB基因序列（登錄號(hào)：FJ844360．1），應(yīng)用Oligo7．0軟件設(shè)計(jì)引物P1、P2，在引物P1、P2的5′端分別引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ，用于PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體的連接，并在引物P1、P2酶切位點(diǎn)后分別引入起始密碼子ATG和終止密碼子TAG。P1／P2擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)270bp，上述引物送上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如下（下劃線處為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），下劃線處為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)的PCR擴(kuò)增以gB基因DNA為模板，分別以P1、P2為上游引物和下游引物，對(duì)PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)進(jìn)行體外擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性，經(jīng)30個(gè)循環(huán)后，于72℃延伸8min?；騼?yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)表達(dá)載體的建立及重組蛋白的表達(dá)與純化將PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳后，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收目的片段，將目的片段連入pMD19－TSimple克隆載體并轉(zhuǎn)化入E．coliDH5α后抽提質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)?；蚪M測(cè)序，并使用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行酶切，將酶切后的目的片段連接入pET32a（＋）載體，并命名重組質(zhì)粒為pET32a（＋）－gB，轉(zhuǎn)化入E．后將重組表達(dá)菌命名為E．。使用濃度為0．2mg／L的IPTG誘導(dǎo)E．重組表達(dá)菌表達(dá)后，將表達(dá)產(chǎn)物通過組氨酸標(biāo)簽融合蛋白純化柱進(jìn)行純化，并測(cè)定純化后的蛋白質(zhì)濃度。PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白的反應(yīng)原性分析以純化的PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白作為抗原，PCMV陽性血清為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG為二抗進(jìn)行試驗(yàn)，并設(shè)置PCMV陰性血清對(duì)照組，鑒定PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白的反應(yīng)原性。多克隆抗體的制備及抗體效價(jià)的測(cè)定使用純化后的PCMVgB基因優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白與弗氏佐劑按1∶1體積比進(jìn)行乳化后制成油乳劑，對(duì)健康家兔進(jìn)行免疫，第4次免疫完成后對(duì)試驗(yàn)家兔采取心血，將血液收集至離心管中，先于常溫傾斜放置30min，再轉(zhuǎn)至37℃培養(yǎng)箱中放置1h，最后轉(zhuǎn)入4℃冰箱中放置過夜，于4000r／min離心15min分離血清。將分離的血清無菌進(jìn)行分裝后于－20℃保存?zhèn)溆?，并避免反?fù)凍融。以純化后的PCMVgB優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白（質(zhì)量濃度為0．62μg／mL）作為抗原，以瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)驗(yàn)證經(jīng)PBS緩沖液稀釋后的多克隆抗體效價(jià)。鑒定以純化的PCMVgB優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白作為抗原，制備的多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗進(jìn)行Western－blot鑒定，以免疫前的家兔血清作為陰性對(duì)照，鑒定該多克隆抗體的反應(yīng)性。

2討論

自1950年P(guān)CMV在英國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來，該病毒就因?yàn)槠涿庖咭种铺匦砸约澳軌蛲ㄟ^跨物種器官移植而感染人與其他動(dòng)物而備受關(guān)注，但由于該病毒分離困難，導(dǎo)致了對(duì)該病毒的研究一直落后于其他皰疹病毒科病毒。囊膜糖蛋白B（gB）是PCMV重要的跨膜糖蛋白，也是特定細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的主要靶蛋白，是淋巴因子激活的自然殺傷細(xì)胞的識(shí)別對(duì)象，且gB蛋白具有良好的免疫原性，并在誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫中起著重要作用，對(duì)該蛋白進(jìn)行研究有助于了解PCMV的感染機(jī)制，為該病毒感染的防治奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)構(gòu)建了pET32a（＋）－gB高效重組表達(dá)質(zhì)粒，應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)以可溶性形式高效表達(dá)了PCMVgB優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白，成功表達(dá)并純化了PCMVgB優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)重組蛋白，并驗(yàn)證了其具有良好的反應(yīng)原性，可以作為間接ELISA檢測(cè)的包被抗原，通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和Western－blot試驗(yàn)，也證實(shí)了制備的多克隆抗體可以與gB蛋白特異性結(jié)合。本研究為進(jìn)一步分析PCMVgB蛋白的生物學(xué)特性，建立PCMV抗體血清學(xué)診斷方法奠定了重要基礎(chǔ)，為制備早期檢測(cè)PCMV抗體的檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

作者：江一帆劉驍單位：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)