淺議氣味蛋白的分子克隆技術(shù)

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1材料和方法

蛹期開始將雌雄分開飼養(yǎng)，羽化后喂以5%的蜂蜜水。養(yǎng)蟲室溫度為26℃，相對(duì)濕度為70%～80%，光周期16D∶8L?？俁NA的提取及cDNA第一鏈的合成為測定氣味結(jié)合蛋白基因的組織表達(dá)譜，取3齡幼蟲頭部和去除頭部的剩余組織，取3日齡雌雄成蟲的不同組織(觸角、去除觸角的頭、胸、腹、足、翅)，其中，雄蟲觸角收取30對(duì)，雌蟲觸角收取40對(duì)，其他組織適量，重復(fù)3次。組織收取后立即放入液氮中，－70℃保存?zhèn)溆?。按照說明書，用SVTotalRNAIsolationSystem提取總RNA，然后用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，－20℃保存?zhèn)溆?。RACE擴(kuò)增利用本研究組委托深圳華大科技有限公司測得的二化螟基因組數(shù)據(jù)，與GenBank中的OBP序列進(jìn)行比對(duì)得到CsupOBP1基因的cDN段。根據(jù)片段序列，設(shè)計(jì)合成5''''GSP和3''''GSP引物。依據(jù)擴(kuò)增試劑盒操作說明，進(jìn)行RACEcDNA第一鏈的合成及PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標(biāo)條帶經(jīng)AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收后，連接到pEASYTM-T3載體上，然后轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的菌落經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取單個(gè)白色菌落放入含有0．1%Amp的LB培養(yǎng)液中，在250r/min、37℃下震蕩培養(yǎng)12～16h后，采用質(zhì)粒提取試劑盒(Omega，USA)提取質(zhì)粒，送南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序。

2序列分析

測定為了明確二化螟OBP1基因的組織表達(dá)譜，利用ABI7500Real-timePCRSystem進(jìn)行了相對(duì)表達(dá)量測定。內(nèi)參基因?yàn)?-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因和轉(zhuǎn)錄延長因子4(E2F)基因，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列。RT-qPCR反應(yīng)體系為模板2．0μL，超純水補(bǔ)足至20μL。采用兩步法標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行擴(kuò)增:95℃預(yù)變性30s;95℃5s，60℃34s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)后進(jìn)行溶解曲線分析，以排除非特異性PCR產(chǎn)物的污染，空白對(duì)照模板以超純水代替cDNA。蛋白的原核表達(dá)與純化根據(jù)二化螟OBP1閱讀框序列及表達(dá)載體pET-30a(+)設(shè)計(jì)帶有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(以下劃線標(biāo)示)的引物序列。以成蟲觸角cDNA為模板，采用高保真性和高擴(kuò)增效率的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase，按照PrimeSTAR說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物回收，再連接到pEASYTM-T3載體中并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒DNA并測序驗(yàn)證。將含有目的片段的重組質(zhì)粒DNA和pET-30a(+)質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行雙酶切，然后將目的片段連接到pET-30a(+)載體，再轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。用含抗生素卡那霉素的LB平板進(jìn)行篩選，挑取陽性克隆，小量提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。經(jīng)測序驗(yàn)證后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂板培養(yǎng)后挑取單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)液(含Kan50μg/mL)中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，將所得菌液按1/100(v/v)的比例接種于新鮮的LB培養(yǎng)液(含Kan50μg/mL)中，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至OD600=0．6時(shí)，加入IPTG(終濃度為1mmol/L)，37℃下250r/min振蕩培養(yǎng)5h。將菌液8000×g離心20min后收集沉淀(菌體)，加入預(yù)冷的Resuspensionbuffer(20mmol/LTris-HCl，0．5mmol/LNaCl，pH7．將沉淀重新懸浮，超聲破碎后用12000×g離心15min，分別收集上清及沉淀，用SDS-PAGE檢測重組蛋白是否為可溶性蛋白。重組蛋白的純化使用裝有填料的親和層析柱XK16/20，對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行腸激酶酶切以切除His-tag標(biāo)簽，酶切后的重組蛋白再次過親和層析柱。純化后的目的蛋白經(jīng)過透析(除鹽)、冷凍干燥后，保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

3熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)

緩沖液中，配成蛋白溶液，測定濃度。熒光探針1-NPN和氣味物質(zhì)(植物揮發(fā)性化合物，見表2)溶于甲醇中，使其終濃度為1mmol/L，作為工作液。以1-NPN為探針，利用熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定氣味物質(zhì)和OBP間的親和力已有很多報(bào)道(Zhouetal．，2004b;Heetal．，2011;Qiaoetal．，2011;孫紅巖等，2011;LiuNYetal．，2012;LiuSJetal．，2012;張婷等，2012;Lietal．，2013)。首先測定CsupOBP1與1-NPN的結(jié)合曲線。將蛋白溶液加入20mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，使其終濃度為2μmol/L，按和20μmol/L的濃度梯度加入1-NPN，每次加入后反應(yīng)2min，在337nm激發(fā)，記錄熒光發(fā)射情況，利用其熒光值計(jì)算出該蛋白與1-NPN的結(jié)合常數(shù)，然后利用競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定氣味物質(zhì)和蛋白的結(jié)合能力。在競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，蛋白和1-NPN的濃度均為2μmol/L，反應(yīng)時(shí)間為2min，在337nm激發(fā)，記錄熒光值(初始熒光值)。然后將被測氣味物質(zhì)按終濃度和20μmol/L的濃度梯度加入到1-NPN和蛋白的混合液中，每次加入后反應(yīng)2min，記錄熒光值。對(duì)于濃度在20μmol/L時(shí)相對(duì)熒光值降到60%以下的氣味物質(zhì)，再進(jìn)行2次重復(fù)試驗(yàn)，以3次重復(fù)計(jì)算有關(guān)參數(shù);對(duì)于結(jié)合能力較低的氣味物質(zhì)，第一次測定后不再進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。計(jì)算熒光值降低到初始熒光值一半時(shí)氣味物質(zhì)的濃度，即IC50值，利用公式Ki=IC50/(1+［1-NPN］/K1-NPN)計(jì)算各氣味物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)，其中［1-NPN］為未結(jié)合的1-NPN濃度，K1-NPN為1-NPN與二化螟OBP1的結(jié)合常數(shù)(Banetal．，2003)。

4EAG反應(yīng)測定

觸角電位儀為荷蘭Syntech公司生產(chǎn)，刺激控制器(型號(hào)CS205)的工作條件為直流電、增益200，氣流速度為3mL/s。其他參數(shù)及詳細(xì)測定步驟參見Yang等(2009)。被測氣味組分用正己烷配制成200ng/μL的工作液，以正己烷為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用微量進(jìn)樣器取5μL滴到濾紙片上(25mm×7．5mm)，放置5min待溶劑揮發(fā)后裝入巴斯德管內(nèi)并用封口膜封閉兩端，在室溫下?lián)]發(fā)5～10min后將封口膜去除并將巴斯德管鏈接到氣路裝置，進(jìn)行EAG反應(yīng)測定。測定試蟲為暗期5～8h的2日齡未交配蛾，每個(gè)氣味組分測定雌雄蟲各6頭(重復(fù))、每頭蟲測定1根觸角，每個(gè)組分在一根觸角上連續(xù)測定3次(間隔30s)。不同組分(包括對(duì)照)的測試順序在6根觸角(重復(fù))間輪換，以消除測定順序?qū)Y(jié)果的影響。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析在Real-timeqPCR測定中，用Q-Gene軟件進(jìn)行表達(dá)量的計(jì)算(Mulleretal．，2002;Simon，2003)，用SAS9．0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行幼蟲不同組織及成蟲雌雄間基因表達(dá)量的差異顯著性分析;采用單因素方差分析及多重比較，檢驗(yàn)二化螟對(duì)不同植物氣味EAG反應(yīng)間的差異。

5結(jié)果與分析

與其他4個(gè)鱗翅目昆蟲的Minus-COBP的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)表明，CsupOBP1具有Minus-COBP的4個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)。將CsupOBP1與8種鱗翅目(4種相似性較高的夜蛾科和4種螟蛾科)昆蟲的50個(gè)OBP構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)，發(fā)現(xiàn)GOBP和PBP各形成一個(gè)大的分支，其余OBP則處于另外2個(gè)大的分支上。本研究克隆的CsupOBP1與同為聚在一起，這些Minus-COBP形成一個(gè)獨(dú)立的分支。CsupOBP1基因的組織表達(dá)譜為了解CsupOBP1基因的功能，利用RT-qPCR技術(shù)檢測了CsupOBP1在幼蟲及雌雄成蟲不同組織的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，在幼蟲期，CsupOBP1基因在頭部的表達(dá)量顯著高于去除頭部的其他組織(P＜0．05);在成蟲期，CsupOBP1主要在足和翅中表達(dá)，在雄蟲的觸角和頭部也較高的表達(dá)，其中在雄蟲觸角內(nèi)的表達(dá)量顯著高于雌蟲觸角。CsupOBP1在幼蟲期的相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于成蟲期，相差20倍以上。CsupOBP1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化為了測定CsupOBP1對(duì)不同氣味物質(zhì)的結(jié)合能力，將重組質(zhì)粒pET/CsupOBP1在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化。首先對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行沉淀并破碎處理，然后對(duì)破碎的細(xì)胞離心分別收取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要存在于上清中;將上清液經(jīng)親和層析柱純化，得到帶有His-tag標(biāo)簽的CsupOBP1;為避免His-tag標(biāo)簽對(duì)CsupOBP1功能測定的影響，用腸激酶對(duì)純化蛋白進(jìn)行處理，切除His-tag標(biāo)簽;處理后的蛋白再次過親和層析柱，獲得大小約14kDa的單一蛋白條帶。

作者：魏丹葉占峰高建清董雙林單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)